大鼠胎儿表皮角质形成层细胞培养

以下是订购信息：

大鼠胎儿表皮角质形成层细胞【Rat Embryo: Normal Fetal Epidermal Keratinocytes】
     产品描述：公司提供的原代细胞均来自新鲜组织，公司提供的大鼠原代细胞均来自新鲜组织，用于培养该细胞的组织采集是根据标准方案进行。细胞的培养采用公司PrimaCellTM原代细胞培养试剂盒来优化目的细胞生长条件，以降低杂细胞的污染，同时保证质量的稳定。在公司生物技术部标准的操作流程下，原代细胞可以保持分化状态，进而可以用于评估体外药物模型系统和调节特定基因的遗传功能。产品仅供科研
 冷冻保存细胞之方法？
冷冻保存方法一: 冷冻管置于4℃ 30~60 分钟→ （-20 ℃30 分钟*） → -80 ℃16~18 小时（或隔夜） → 液氮槽vaporphase 长期储存。
冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下， 再放入液氮槽vapor phase长期储存。*-20 ℃不可超过1 小时， 以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃ 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

 

培养操作：
1）复苏细胞：将含有 1mL 细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，加 入 4mL 培养基混合均 匀。在 1000RPM 条件下离心 4 分钟，弃去上清液，补 加 1-2mL 培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培 养过夜（或将 细胞悬液加入 10cm 皿中，加入约 8ml 培养基，培养过夜）。第二天换液并 检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达 80%-90%，即可进行传代培养。      
1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的 PBS 润洗细胞 1-2 次。
2. 加 1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于 37℃培 养箱中消化 1-2 分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分 变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养 瓶后加少量培养基终止消 化。  
3. 按 6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在 1000RPM 条件下离心 4 分 钟，弃去上清液，补加 1-2mL 培养液后吹匀。
4. 将细胞悬液按 1：2 比例分到新的含 8ml 培养基的新皿中或者瓶中。
3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面 T25 瓶为类；
1. 细胞冻存时，弃去培养基后，PBS 清洗一遍后加入 1ml 胰酶，细胞变圆 脱 落后，加入 1ml 含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。
2. 4 min 1000rpm 离心去掉上清。加 1ml 血清重悬细胞，根据细胞数量加 入血 清和 DMSO，轻轻混匀，DMSO 终浓度为 10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存 1ml 细胞悬液，注意冻 存管做好标识。
3. 将冻存管置于程序降温盒中，放入-80 度冰箱，2 个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
细胞培养操作规程：
一．培养基及培养冻存条件准备：
1）准备RPMI-1640培养基(RPMI-1640：GIBCO，货号21875-091)，90%；优质胎牛血清，10%。
2）培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。
3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配，液氮储存。
二．细胞处理：
1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于冻存管盖部）摇晃解冻，移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
对于悬浮细胞，传代可参考以下方法：
方法一：收集细胞，1000RPM，常温条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
下列是公司正在促销产品：

小鼠血清总补体(CH50)ELISAKit   ELISA.   96T/48T  Methyltestosterone  中文名：甲基睾酮  分子式：C20H30O2  度：98.0%

小鼠血清淀粉样蛋白elisa试剂盒   小鼠血清淀粉样蛋白试剂盒   规格型号：96T/48T   小鼠血清淀粉样蛋白试剂盒，规格型号：96T/48T，来源：elisa试剂盒（进口分装），产品别名：小鼠血清淀粉样蛋白试剂盒、小鼠血清淀粉样蛋白elisa试剂盒   保存条件：2-8℃   保质期：6个月。     Metronidazole  443-48-1  中文名：甲硝唑  分子式：C6H9N3O3 

小鼠血清淀粉样蛋白A(SAA)ELISA试剂盒   96T/48T   试剂盒   组装/原装           Minisecolide C  1967030-77-8  中文名：  分子式：C28H34O7 

小鼠血清淀粉样蛋白(mouse SAA)   作用：   ELISA   规格：   48T/96T   进口分装     Gliquidone  33342-05-1  中文名：格列喹酮  分子式：C27H33N3O6S 

小鼠血清(NO)ELISA试剂盒   96T/48T   试剂盒   组装/原装  Minisecolide C  1967030-77-8  中文名：  分子式：C28H34O7  度：%  关键词：

小鼠补体C5a(mouse C5a)   作用：   ELISA   规格：   48T/96T   进口分装     Benzo-15-crown 5-ether  中文名：苯并-15-冠5-醚  分子式：C14H20O5 

小鼠补体C3a(mouse C3a)   作用：   ELISA   规格：   48T/96T   进口分装  Benzo-15-crown 5-ether  中文名：苯并-15-冠5-醚  分子式：C14H20O5  度：98.0%

小鼠补体1抑制物抗体(C1INH)ELISA试剂盒   96T/48T   试剂盒   组装/原装  Chrysophanol 8-O-glucoside  13241-28-6  中文名：  分子式：C21H20O9  度：97.5%  关键词：  抗血小板; 抗凝; 大黄属; 鼠李属; 酸模属; 蒽醌苷; 中药对照品; 中药标准品; 植物提取物; 天然产物; 天然产物库

小鼠病毒（MVM）ELISA试剂盒   96T/48T   试剂盒   组装/原装  Losartan  114798-26-4  中文名：氯沙坦  分子式：C22H23ClN6O  度：98.0%  关键词： 

小鼠表皮调节素elisa试剂盒   小鼠表皮调节素试剂盒   规格型号：96T/48T   小鼠表皮调节素试剂盒，规格型号：96T/48T，来源：elisa试剂盒（进口分装），产品别名：小鼠表皮调节素试剂盒、小鼠表皮调节素eisa试剂盒   保存条件：2-8℃   保质期：6个月。  Lamivudine  134678-17-4  中文名：拉米夫定  分子式：3O3S  度：98.0%  关键词：

兔白介素17(IL-17)ELISAKit   ELISA.   96T/48T  4-Benzoyloxy-2-azetidinone  28562-58-5  中文名：4-苯甲酰氧基-2-氮杂环丁酮  分子式：C10H9NO3  度：98.0%   

兔白介素-12(rabbit IL-12)   作用：   ELISA   规格：   48T/96T   进口分装     4-Benzyl N-carbobenzoxy-L-aspartate  中文名：N-苄氧羰基-L-天冬氨酸-4-苄脂  分子式：C19H19NO6 

兔白介素-10(rabbit IL-10)   作用：   ELISA   规格：   48T/96T   进口分装  4-Benzyl N-carbobenzoxy-L-aspartate  中文名：N-苄氧羰基-L-天冬氨酸-4-苄脂  分子式：C19H19NO6  度：98.0%

兔白介素1（IL-1）ELISA试剂盒   96T/48T   试剂盒   组装/原装  4-Benzyl N-(tert-butoxycarbonyl)-L-aspartate  中文名：N-(叔丁氧羰基)-L-天冬氨酸-4-苄酯  分子式：C16H21NO6  度：98.0%

兔阿霉素(ADR)ELISA试剂盒   96T/48T   试剂盒   组装/原装           4-Benzyl N-(tert-butoxycarbonyl)-L-aspartate  中文名：N-(叔丁氧羰基)-L-天冬氨酸-4-苄酯  分子式：C16H21NO6

Tenacissoside H  191729-45-0  中文名：通关藤苷H  分子式：C42H66O14  度：98.0%  关键词：  通光散; 孕甾烷; 中药对照品; 中药标准品; 植物提取物; 天然产物; 天然产物库  小鼠氧化酶(DAO)ELISAKit   ELISA.   96T/48T           

Tenacissoside G  191729-43-8  中文名：通关藤苷G  分子式：C42H64O14  度：%  关键词：  通光散; 通关藤; 孕甾烷; 植物提取物; 天然产物; 天然产物库  小鼠乙酰胆碱受体抗体(AChRab)ELISA试剂盒   96T/48T   试剂盒   组装/原装

Tenacissoside F  928151-78-4  中文名：通关藤苷F  分子式：C35H56O12  度：%  关键词：  通关藤; 孕甾烷; 植物提取物; 天然产物; 天然产物库  小鼠乙酰胆碱(ACH)ELISA试剂盒   96T/48T   试剂盒   组装/原装

Tenacigenoside A  920502-42-7  中文名：  分子式：C35H56O12  度：%  关键词：  孕甾烷; 甾苷; 植物提取物; 天然产物; 天然产物库  小鼠胰高血糖素样肽1(GLP-1)ELISA试剂盒   96T/48T   试剂盒   组装/原装

Tenacigenin B  80508-42-5  中文名：  分子式：C21H32O5  度：%  关键词：  通光散; 孕甾烷; 植物提取物; 天然产物; 天然产物库  小鼠胰高血糖素（GC）ELISA试剂盒   96T/48T   试剂盒   组装/原装

实验报告：

大鼠胎儿表皮角质形成层细胞培养一、分离与培养：
    1、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次，后将组织剪成1mm3左右大小；
    2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 胰酶和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；
    3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织完全被消化；
    4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养；
    5、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；
二、免疫荧光鉴定：
    1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；
    2、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；
    3、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min；
    4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜；
    5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h；
    6、用PBS冲洗3次，每次10min，后在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。